Análise teórico-experimental de métodos de vitrificação para aplicações de criopreservação de sêmen

O sucesso de um procedimento de criopreservação de células está diretamente relacionado com o procedimento de preparação do material biológico, o método de congelamento empregado, o volume da amostra e a relação entre a taxa de resfriamento e a concentração/tipo de agentes crioprotetores. De modo a evitar a formação de cristais de gelo, a velocidade de resfriamento da amostra deve ser maior que a velocidade de formação dos cristais. Através do método de vitrificação, é possível conseguir elevadas taxas de resfriamento, fazendo com que a amostra faça uma transição direta do estado líquido para o estado vitrificado e amorfo, sem a formação de cristais de gelo. Quanto maior a taxa de resfriamento, maior a viscosidade e menor o volume da amostra, maior será a chance de vitrificar uma solução. A vitrificação é bastante é mais utilizada quando se trabalha com materiais biológicos de pequeno volume e baixa concentração de água intracelular, tal como aplicações de criopreservação de sêmen. Neste trabalho foram desenvolvidos dois métodos de criopreservação de sêmen, sendo o método de vitrificação por imersão direta e o método de vitrificação de gotículas por contato. Foi conduzida uma investigação experimental e numérica, através do projeto e construção de bancadas e equipamentos, simulações computacionais, avaliação e proposição de metodologias. Para o método de vitrificação de gotas por contato, investigou-se o comportamento do avanço da solidificação, taxas de resfriamento, ângulo de contato, geometria e material da superfície de resfriamento. Para o método de vitrificação por imersão direta, foi investigada a influência do meio de resfriamento, comparando a imersão em nitrogênio líquido (LN2) com slush de nitrogênio (SN2). Também foi avaliado o efeito do tipo de recipiente para alocação das amostras, comparando criotubos com chips de PDMS, comparando diferentes concentrações de CPA e o impacto do volume no processo de criopreservação. Os testes biológicos com sêmen investigaram a influência do método de processamento (lavagem simples e swim-up), e protocolo de congelamento, quanto à taxa de resfriamento, viabilidade e motilidade. Os resultados neste trabalho corroboram para o aprimoramento e desenvolvimento de novos métodos e protocolos para criopreservação de materiais biológicos, especialmente para aplicações de vitrificação de sêmen.